Типы ПЦР

Полимеразная цепная реакция впервые применена ученым по имени Кэрри Мюллис. Этот человек разработал методику в первую очередь для исследований в молекулярной биологии. Только потом была понята истинная польза открытия.

ПЦР стали широко применять в медицинской практике для диагностики заболеваний, включая различные инфекции, передающиеся половым путем.

В чем принцип метода ПЦР, часто спрашивают пациенты у врачей, и какие виды диагностики существуют.

Чем отличается количественный и качественный подходы, и что значит ПЦР в реальном времени?

Принцип метода

Любой живой организм на планете обладает уникальной генной структурой, которая входит в состав РНК или ДНК и не повторяется.

Естественно, у вирусов и бактерий также имеются генетические «ключи», характерные последовательности, позволяющие определить наличие в организме. Именно на обнаружение этих последовательностей и направлено действие ПЦР. Все очень просто.

Благодаря использованию специальных ферментов и аппарата ученым удается многократно скопировать необходимые участки ДНК или РНК, а затем провести распознание.

ПЦР-методика относится к высокотехнологичным исследованиям. Чтобы выполнять ее, лаборатория должна быть оснащена тремя раздельными зонами. В каждой из которых существуют свои особые правила работы.

Естественно, пренебрежение этими правилами нередко ведет к тому, что результаты ПЦР получаются неправильными.

Всего выделяют три основных этапа, входящих в цикл ПУР:

• разделение ДНК-цепи на две отдельных под воздействием высокой температуры;
• присоединение при соблюдении ряда условий специальных синтетических ферментов, которые называются праймерами;
• достраивание с помощью специального фермента праймерами выделенного участка ДНК до полноценной двухцепочечной спирали.

Три этих действия, повторяющихся друг за другом по кругу получили название цикла амплификации. Таких циклов может быть сколько угодно много.

Преимущества и недостатки

Полимеразная цепная реакция – метод, получивший в последние годы широкое распространение в диагностической медицине. Однако, как отмечают доктора, он не лишен как преимуществ, так и недостатков.

К преимуществам принято относить:

• возможность получить результаты исследования в короткие сроки (от нескольких часов до суток), что значительно превосходит классические методы микробиологии;
• высокую точность диагностики, которая достигает 100% благодаря уникальности ДНК каждого микроорганизма, вируса или бактерии;
• высокую чувствительность, благодаря которой возбудитель обнаруживается в биологическом материале даже в том случае, если там совсем немного, и вирус ил бактерия еще не успел размножиться;
• возможно выполнение как качественного, так и количественного анализа, что особенно важно при работе с условно-патогенными микроорганизмами, которые в низких концентрациях даже не вызывают симптомов болезни;
• ПЦР качественный на гепатит C, ВИЧ и некоторые другие микроорганизмы способен определить не только их присутствие в организме, но и принадлежность к конкретному штамму, что позволяет максимально оптимизировать выбор лекарственных средств;
• использовать методику можно не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в определении генетических патологий, которые могут быть переданы по наследству;
• биологическим материалом для исследования могут служить не только жидкости макроорганизма, но и частицы ткани при необходимости, что значительно облегчает выбор способа забора биоматериала.

Однако, как отмечают доктора, ПЦР имеет и ряд серьезных недостатков.

К ним относят:

• довольно высокую цену на исследование, которая может оказаться по карману не всякому пациенту;

• возможность получения неверных результатов в том случае, если пациент неверно подготовился к исследованию, биоматериал был забран неправильно или не соблюдались правила выполнения исследования;
• обеспечение лаборатории высокотехнологичными устройствами и дорогостоящими реагентами для выполнения диагностики;
• обеспечение лаборатории работниками, которые будет четко знать, как выполняется исследование, и какие правила нужно соблюдать, чтобы результаты получились достоверными.

Виды диагностики

Сегодня в практике врача выделяются различные разновидности ПЦР. Применение разных видов позволяет легко получить необходимую информацию. Если есть возможность выполнить исследование и правильно расшифровать результаты.

Количественная и качественная

В первую очередь полимеразная цепная реакция делится на количественную и качественную. В первом случае оценивается не только наличие в организме патогенных вирусов, бактерий или грибков, но и их количество. Методика широко используется для того, чтобы проводить контроль лечения.

Без нее нельзя представить себе, например, терапию ВИЧ-инфекции.

ПЦР количественная гепатит C также позволяет с успехом контролировать при лечении. На ее основании проводится подбор препаратов, выбор оптимальных дозировок и их коррекция.

Качественный анализ, в отличие от количественного, позволяет просто понять, есть ли возбудитель в организме, или он полностью отсутствует.

ПЦР на туберкулез, хламидиоз и некоторые другие болезни выполняется в основном именно в качественном варианте. Потому что важно определить не количество патогенов, а их наличие в макроорганизме человека.

ПЦР на герпес 6 типа или других типов может носить как качественный, так и количественный характер, как отмечают врачи. Все зависит от того, как доктор в дальнейшем планирует использовать результаты.

В каждом отдельном случае решение о том, ПЦР качественный или количественный необходим пациенту принимает доктор. Врач ориентируется на предполагаемое заболевание и дальнейшую свою тактику. Если он планирует контролировать с помощью этого исследования лечение, логичнее отдать предпочтение количественному варианту. Если планируется просто определить присутствие патогена, независимо от количества, то хватит и качественной реакции.

Реальное время

Real time PCR также известна в русском переводе под названием ПЦР в реальном времени или реальной ПЦР. Методика ее постановки довольно проста, часто под ней понимают количественный вариант анализа. Все дело в том, что количество вырабатываемых амплификационных продуктов в этом случае регистрируется специальным прибором.

Не под конец реакции, а в течение всего периода времени. В результате строится кривая, по которой оценивают особенности протекания реакции, а также подсчитывают количество ДНК в биологическом материале.

Естественно, учитывается в расчетах только та ДНК, что характерна для искомого возбудителя. В некоторых случаях для повышения точности реакции к ней добавляют специальные флуоресцирующие зоны или красители. Благодаря ним вероятность обнаружения необходимых участков ДНК.

Считается, что реал-тайм ПЦР – это более простой и быстрый вариант в сравнении с качественным анализом. Также при ней не требуется держать пробирки открытыми. Из-за чего вероятность загрязнения окружающих образцов сведена к минимуму. Однако реагенты и аппаратура для подобных реакций считаются более дорогими, а значит возрастает и стоимость исследования.

Обратная транскрипция

Сейчас стало хорошо известно, что в мире существует множество вирусов, которые не имеют ДНК структуры.

Естественно, ученые задались вопросом о том, как диагностировать такие вирусы, и появился вариант ПЦР с обратной транскрипцией. Если предполагаемым возбудителем является РНК-содержащий вирус, то перед тем, как начинать ПЦР, биологический материал пациента обрабатывают специальным ферментом, который называется ревертазой.

Ревертаза способствует превращению РНК-молекул в ДНК. Впоследствии их уже легко амплифицируют с помощью стандартной полимеризации и идентифицируют. Именно благодаря методу обратной транскрипции появилась возможность диагностировать заболевания, вызванные РНК-содержащими вирусами. 

RAPD-вариант

RAPD-методика – это методика, основанная на случайной амплификации полиморфной ДНК-молекулы. При этой методике все, что используется – это один праймер и любая произвольная последовательность нуклеотидов.

Метод обладает высокой чувствительностью к изменениям условий внешней среды. Он среагирует изменением показателей на изменение буфера, реагентов и множество других условий. Чтобы расценивать исследование, как достоверное, нужно использовать разные праймеры. К значительному преимуществу метода относится то, что он не только позволяет получить результаты довольно быстро, но и оценивается, как дешевый по затратам. Метод практически не применяют в медицине, но активно используют в науке.

ПЦР по принципу случайной амплификации полиморфной молекулы ДНК расценивают врачи и ученые, как скрининг-методику. Если необходима обработка большого объема информации в кроткие сроки. 

Другие варианты

Существуют и другие варианты полимеразной цепной реакции, которые могут применяться врачами для постановки диагноза.

К ним относят, например:

• инвертирование, при котором подразумевается, что известен только небольшой участок последовательности ДНК, но не полноценная структура, полезен в том случае, если планируется определять соседние последовательности;

• вложение, при котором количество побочных продуктов реакции существенно снижается, благодаря чему получается получить достоверные и чистые результаты, вызывающие доверие;
• асимметрия, которая применяется в том случае, если амплификации планируется подвергнуть только одну из двух цепочек, в медицине применяется в исключительно редких случаях;
• ступенчатый вариант, при котором увеличивается чистота реакции за счет того, что уменьшается неспецифическое влияние различных ненужных участков на праймеры;
• групп-специфический вариант, который позволяет легко определить последовательности у схожих микроорганизмов или других возбудителей благодаря использованию нескольких сходных по структуре праймеров.

Даже в современных частных лабораториях практикуют применение далеко не всех вариантов полимеразной цепной реакции. Да и, как отмечают врачи, конкретно в диагностике различных заболеваний не во всех них есть необходимость. Некоторые варианты так и остались сугубо научными методиками, которые применяются в молекулярной биологии.

ПЦР-исследование – эффективный, хоть и дорогой метод диагностики инфекционных болезней. Особенно часто полимеразную цепную реакцию назначают при подозрении на заболевания, способные передаваться от человека к человеку половым путем. С помощью методики можно не только выставить диагноз, но и контролировать лечебные мероприятия!

Для сдачи любых ПЦР анализов обращайтесь в нашу клинику.